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低温生物菌种的液氮冷冻保藏法

(1)准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求---受温度突然变化而不致破碎，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，低温生物菌种价格，或能容1.2mm液体的。

(2)加保护剂与灭菌保存---、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，低温生物菌种，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟:若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲---蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>;，121.3℃灭菌15分钟。

(3)接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，低温生物菌种公司，装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

(4)---再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速---至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

(5)保藏经---至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器(图ⅶ-14)的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

(6)恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢---、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

生物有机肥产品生产菌种安全性分析

虽然目前生物有机肥产品生产菌种大多采用植物根际促生菌， 但近年来很多研究发现，芽孢菌属和类芽孢菌个别菌株能产生菌素。 即便在菌种安全分级目录中列为一级免做理学试验的菌种， 如枯草芽孢菌、 多类芽孢菌、 地衣芽孢菌等个别菌株也检测到部分溶血素基因， 潜在危害不容忽视。 因此， 开展生物有机肥产品生产菌种生物安全风险评价， 从源头上把好菌种安全关是产品安全的首要保障。通过---发现， 用于生物有机肥产品的部分生产菌种分类---不明确， 甚至混乱， 难以从源头上进行安全风险的初步识别 。 以常见生产菌种枯草芽孢菌为例， 实际上是一个表型相似的群体， 包括枯草芽孢菌、 地衣芽孢菌、 短小芽孢菌、解淀粉芽孢菌、 深褐 （萎缩） 芽孢菌、莫哈韦（莫杰夫） 芽孢菌、 死谷芽孢菌、 索诺拉沙漠芽孢菌、 特基拉芽孢菌、暹罗芽孢菌等 10个缘种。生产企业送检的枯草芽孢菌生物有机肥产品， 经鉴定发现很多产品实际为解淀粉芽孢菌， 且许多菌株具有很强的溶血作用。通过对生产企业---发现， 部分生产企业选择分离于动物肠道的解淀粉芽孢菌作为产品生产用菌株， 该类菌种生产发酵周期短、 活菌数量高、 生产成本低， 但产品的应用功效不佳， 溶血风险大 ， 建议慎用。而植物来源的解淀粉芽孢菌溶血风险小， 产品应用效果好， 使用。