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低温生物菌种的液氮冷冻保藏法

(1)准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求---受温度突然变化而不致破碎，低温生物菌种，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，低温生物菌种价格，或能容1.2mm液体的。

(2)加保护剂与灭菌保存---、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟:若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲---蒸馏水溶液，低温生物菌种报价，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>;，121.3℃灭菌15分钟。

(3)接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

(4)---再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速---至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

(5)保藏经---至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器(图ⅶ-14)的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

(6)恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢---、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

 低温生物菌种贮存的方式

1.冷冻真空干燥法。将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本较高。

  2.液氮---温保藏法。首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，低温生物菌种厂家，准备安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安瓿瓶放在---器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地---，直至-35℃，以后---速度就不需控制，安瓿---后立即放入液氮罐内，在-150至-196℃保藏，该法只有少数科研院所使用。